撰文︱郝嘉玮，吴甜甜
责编︱王思珍，方以一
编辑︱杨彬薇
登革热病毒（dengue virus，DENV）主要通过感染病毒的埃及伊蚊和白纹伊蚊叮咬而在人群中传播，被感染者通常出现登革热（dengue fever，DF），多数表现为发热、肌肉和骨头疼痛、疲惫无力等症状，有时会发展为可能致命的重症登革热，包括登革出血热（dengue hemorrhagic fever，DHF）与登革热休克综合征（dengue shock syndrome，DSS）。目前，没有特异的抗登革药物，也仅有一种登革疫苗在少数几个国家获得使用许可，且只用于流行区的9-45岁人群。世界卫生组织（WHO）数据显示近几十年全球登革热发病率大幅上升，已有120多个国家有登革相关报道。登革已经成为发病人数最多、分布范围最广的虫媒病之一。2019年，WHO将登革列为全球健康十大威胁之一[1]。
在DENV感染中，病毒蛋白或RNA与宿主细胞发生复杂的相互作用，虽然已发现并研究了多个参与调控病毒感染的宿主因子的作用机制，但我们对异常复杂的细胞抵制DENV感染的分子调控网络仍知之甚少。其中，细胞模式识别受体（PRRs）的核苷酸结合寡聚结构域样受体家族（NLRs）在对抗微生物感染的固有免疫中起重要作用[2]，其家族中的NLRC5分子在免疫细胞中大量表达，参与炎症小体途径、MHC-I抗原呈递、NF-kB、干扰素信号以及病原体防御等生物过程[3-6]。有报道NLRC5参与细胞抗病毒免疫反应，但机制还不清楚（正调控或负调控均有报道）[5-7]，且是通过NLRC5调节宿主免疫反应来实现的。对于NLRC5是否直接作用于病毒蛋白或核酸，未见有研究报道。
2022年9月20日，中山大学中山医学院李义平教授团队在Autophagy（2022 IF=13.391）在线发表题为“NLRC5 restricts dengue virus infection by promoting the autophagic degradation of viral NS3 through E3 ligase CUL2 (cullin 2)”的研究论文[8]，中山大学为第一完成单位，博士生郝嘉玮为唯一第一作者（2022年博士毕业），李义平教授为通讯作者。该研究证明了NLRC5通过介导DENV一个多功能蛋白NS3的降解而发挥抗病毒作用，发现NLRC5-CUL2-NS3-TOLLIP的抗病毒新分子信号轴。该研究拓展了我们对NLRC5在宿主防御病毒感染中的调控网络的认识。（文末附李义平团队有关DENV的最新研究成果概述）。
本研究首先用DENV感染不同细胞系，发现DENV感染后NLRC5的表达均显著上调，敲除NLRC5和过表达NLRC5可分别促进和抑制DENV感染，其中NLRC5 CARD结构域在抑制DENV感染中起主要作用。因此，作者强调NLRC5在DENV感染宿主的过程中发挥着非常关键的作用。作者利用免疫共沉淀（IP）技术等一系列实验证实了上述猜想。作者研究发现NLRC5 CARD结构域与NS3蛋白酶结构域（protease domAIn）可直接相互作用，并促使NS3通过泛素依赖的选择性巨自噬/自噬途径降解。随后，通过IP、质谱技术、以及一系列实验进行了机制解析。实验证明NLRC5招募E3泛素连接酶CUL2，对NS3进行K48-linked类型泛素化修饰，被泛素化的NS3被自噬受体TOLLIP识别并运送至溶酶体进行降解（图1和2）。因此，作者提出NLRC5通过激活NLRC5-CUL2-NS3-TOLLIP的新颖分子信号轴，抑制DENV病毒感染（图3）。此外，研究还发现NLRC5也介导同是黄病毒科的寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）和日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）的NS3蛋白降解。因此，NLRC5介导NS3降解可能具有抗多种黄病毒的作用。
图1. NLRC5通过TOLLIP受体促进NS3的自噬降解（图源：Jiawei Hao, et al., Autophagy, 2022）
图2. NLRC5招募E3连接酶CUL2对NS3进行泛素化而使其发生自噬降解（图源：Jiawei Hao, et al., Autophagy, 2022）
图3. NLCR5抑制DENV感染的NLRC5-CUL2-NS3-TOLLIP分子作用轴模型（图源：Jiawei Hao, et al., Autophagy, 2022）
文章结论与讨论，启发与展望
本研究为NLRC5作为DENV感染的限制因子提供了直接证据，拓展了我们对NLRC5的抗病毒调控分子机制的理解（图3）。研究探明了NLRC5通过介导下游分子对病毒多功能蛋白NS3进行泛素化自噬方式发生降解，证明了NLRC5-CUL2-NS3-TOLLIP新分子信号轴，扩展了我们对NLR家族成员在宿主防御系统中的功能认识。研究还发现NLRC5也介导ZIKV和JEV中的NS3的降解，提示介导NS3降解可能是NLRC5抗多种黄病毒的通用分子机制。
本研究基于体外细胞转染和DENV病毒感染实验，发现并验证了NLRC5-CUL2-NS3-TOLLIP自噬的新分子信号轴拮抗DENV病毒感染的新机制。新分子信号轴的发现固然重要，但其在活体环境中（如小动物或人体感染）的表现，及其重要性和潜在应用，本研究尚未进行探索，这将是未来值得进一步研究回答的重要科学问题。在本研究中，作者还观察到NLRC5也可介导ZIKV和JEV的NS3降解，因此推测此信号轴也可能是NLRC5拮抗其它黄病毒感染的通用机制。虽然黄病毒生命周期与感染过程较为相似，但仍需进行特定病毒的多方实验来验证这信号轴是否普适于多种黄病毒。此外，本研究只确定在NS3的蛋白酶结构域发生多位点K48-linked型泛素化，并未明确到具体的赖氨酸位点，这也是值得进一步研究的方面。
原文链接：https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15548627.2022.2126614
以下内容为：李义平团队研究领域简介及DENV相关最新研究成果简述
该团队主要从事黄病毒科病毒的基础研究，包括丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV），DENV和寨卡病毒（Zika virus，ZIKV），在HCV分子病毒学和细胞感染模型上有系统的研究成果（可见PubMed）。近年开始结合中山大学热带病防治研究教育部重点实验室的主要发展方向，拓展到DENV和ZIKV病毒的研究，并完成了DENV四种血清型（DENV-1~4）的全长感染性克隆和DENV-2~3的复制子系统的构建。于2022年9月18号，该团队在Viruses（2022 IF=5.82）上发表了“Development and Characterization of a Genetically Stable Infectious Clone for a Genotype I Isolate of Dengue Virus Serotype 1”的研究论文，硕士生胡明玥为唯一第一作者（广西大学与中山大学联合培养）[9]。该研究报道了DENV-1基因I型临床株的全长感染性克隆的构建策略，并鉴定提高病毒感染滴度的适应性突变，验证了该克隆在转化受体细菌中具有遗传稳定性，及其用于研究抗DENV化合物分子的适用性，为DENV-1（特别是基因I型）的研究提供了基础实验工具（DENV-3~4的数据待发表）（图4）。
图4. DENV-1基因I型感染性克隆的构建策略及其在转化受体细菌中的稳定性验证（图源：Mingyue Hu, et al. Viruses, 2022）。
原文链接：https://www.mdpi.com/1999-4915/14/9/2073
2022年1月，该团队还在Reviews in Medical Virology （2022 IF=11.04）杂志上发表了题为“Dengue fever and dengue virus in the People's Republic of China”的综述论文，博士生吴甜甜为第一作者。该文章综合分析了近几十年中国登革热的现状，主要包括登革疫情时间与地理位置，以及四种血清型和多种基因型等的流行规律；对我国登革热与媒介控制的新策略进行了概述，为全球登革热的预防和控制提在供科学参考（图5）。
图5. DENV在中国的流行现状，以及不同病媒控制策略的发展与应用（图源：Tiantian Wu, et al., Rev Med Virol, 2022）
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/rmv.2245
该团队还涉及黄病毒科病毒感染致宿主细胞炎症与氧化应激研究，曾以HCV、DENV、ZIKV、JEV、西尼罗病毒（WNV）和脾传脑炎病毒（TBEV）为代表，探讨了黄病毒感染诱导氧化应激及其与疾病发生机制的关系，分析主要调控的分子机制，在Oxidative Medicine and Cellular Longevity（IF=7.31）上发表了题为“Flaviviridae Viruses and Oxidative Stress: Implications for Viral Pathogenesis”的论文（图7），（其它数据待发表）。张真真博士为第一作者。
图7. 黄病毒感染与自噬小体、ROS产生、Nrf2信号的互作模型
（图源：Zhenzhen Zhang, et al.,Oxid Med Cell Longev）
原文链接：https://www.hindawi.com/journals/omcl/2019/1409582/
此外，该课题组还构建具有遗传稳定性的真核启动的ZIKV亚洲系毒株的全长感染性克隆（Chen et al. 2018 Virus Research; DOI: 10.1016/j.virusres.2018.08.016）[10]，以及利用这些复制和感染模型研究宿主细胞抗黄病毒免疫和病毒逃逸等问题；与中山大学生科院崔隽教授合作，发现ZIKV通过NS1-caspase-1轴裂解cGAS，引发炎症以逃避细胞抗病毒反应（Zheng, Liu, Wu et al. 2018 EMBO J; DOI: 10.15252/embj.201899347）[11]。
该课题组得到国内外不同来源的科研基金资助，在中山大学中山医学院、人类病毒学研究所、热带病教育部重点实验室等实验平台的支持下完成上述研究工作。
文所及各第一作者：郝嘉伟（二排左四）、胡明玥（一排左七）、吴甜甜（一排左八）、张真真（一排左四），通讯作者：李义平教授（一排左六）（图片提供自：李义平教授团队）
通讯作者简介（上下滑动阅读） 李义平教授，国家引进高层次人才，现任中山大学中山医学院病原生物学与生物安全系、人类病毒学研究所、热带病防治教育部重点实验室教授。长期从事RNA病毒的研究，形成了以黄病毒科的丙肝病毒（HCV）、登革病毒（DENV）和寨卡病毒（ZIKV）的分子病毒学、细胞感染模型、抗病毒药物与免疫逃逸为主的研究方向，同时关注基因修饰重组病毒的生物安全与冠状病毒（如新冠SARS-CoV-2等）中和抗体等研究。在PNAS、EMBO J、Nat Microbiol、Gastroenterology、JBC等国内外知名期刊上发表论文50余篇，Web of Science统计H指数20。J Clin Virol、Tumor Virus Res等杂志编委。获美国和欧盟专利5项，申请中国专利7项。获欧盟“2020地平线”计划、国家重点基础研究计划、国家重点研发计划、国家自然科学基金等基金资助，并与海外多个科研团队开展合作研究。
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参考文献（上下滑动阅读） (1) WHO. Ten threats to global health in 2019: WHO; 2019 [cited 2022 1 October 2022]. Available from: https://www.who.int/news-room/spotlight/ten-threats-to-global-health-in-2019.
(2) Geddes K, Magalhaes JG, Girardin SE. Unleashing the therapeutic potential of NOD-like receptors. Nat Rev Drug Discov. 2009;8(6):465-79.
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(5) Cui J, Zhu L, Xia X, Wang HY, Legras X, Hong J, Ji J, Shen P, Zheng S, Chen ZJ, Wang RF. NLRC5 negatively regulates the NF-kappaB and type I interferon signaling pathways. Cell. 2010;141(3):483-96.
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(8) Hao J, Li J, Zhang Z, Yang Y, Zhou Q, Wu T, Chen T, Wu Z, Zhang P, Cui J, Li YP. NLRC5 restricts dengue virus infection by promoting the autophagic degradation of viral NS3 through E3 ligase CUL2 (cullin 2). Autophagy. 2022:1-16.
(9) Hu M, Wu T, Yang Y, Chen T, Hao J, Wei Y, Luo T, Wu D, Li YP. Development and Characterization of a Genetically Stable Infectious Clone for a Genotype I Isolate of Dengue Virus Serotype 1. Viruses. 2022;14(9).
(10) Chen Y, Liu T, Zhang Z, Chen M, Rong L, Ma L, Yu B, Wu D, Zhang P, Zhu X, Huang X, Zhang H, Li YP. Novel genetically stable infectious clone for a Zika virus clinical isolate and identification of RNA elements essential for virus production. Virus Res. 2018;257:14-24.
(11) Zheng Y, Liu Q, Wu Y, Ma L, Zhang Z, Liu T, Jin S, She Y, Li YP, Cui J. Zika virus elicits inflammation to evade antiviral response by cleaving cGAS via NS1-caspase-1 axis. Embo j. 2018;37(18)
本文完
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