重组腺病毒的制备 1.1 细胞转染（以转染 6孔板为例）
① 250μl DMEM和9μl PEI配成Mix1，静置5min以上。
② 250μl DMEM和1μg穿梭质粒、2μg包装质粒（即腺病毒骨架质粒），配成Mix2。
③ 将Mix1和Mix2混合，涡旋振荡混匀，瞬离后，静置30min以上，以便有充足的时间形成DNA-PEI复合物。
④ 静置期间铺6孔板HEK293细胞，细胞数约0.3-0.5×106个/孔（也可提前铺板）。
⑤ 将静置后的混合液逐滴加入至6孔板细胞中。十字混匀后置于CO2培养箱中培养。 1.2 扩增、收毒步骤
① 转染后约14天，将六孔板中有CPE的细胞连同培养基吹下加入至10cm dish，混匀后置于 CO2培养箱中培养。
② 收集有CPE的10cm dish细胞，用电动移液器转移至 15mL离心管中，并做好相应的标记；
③ 3500rpm,离心7min；离心完成后，取出离心管，保留细胞沉淀，并将上清保存至其他离心管中备用。
④ 在细胞沉淀中加入腺病毒冻存液，用移液枪不断地吹打沉淀，保证完全回溶，吸到1.5mL EP管中。
⑤ -80℃及 37℃反复冻融四次。
⑥ 冻融完成后，12000g离心2min。
⑦ 将上清用1mL枪移到二维码管中，存放于-80℃的冰箱中。 1.3 大量扩增及收毒步骤
① 将收集起来的病毒上清平均滴加到10个10cm dish中，混匀后置于CO2培养箱中培养，2-3天后收毒；
② 收集有CPE的10个10cm dish细胞，用电动移液器转移至50ml离心管中，并做好相应的标记；
③ 3500rpm,离心7min，分别收集上清和细胞沉淀；
④ 病毒上清加入PEG8000和NaCl，混匀后4℃直立放置过夜；细胞沉淀置于-80℃保存备用。 1.4 纯化前的处理
① 病毒上清处理
a. 第二天将4℃过夜的上清离心，3500g，4℃，离心 30min；
b. 离心后弃掉上清，收集病毒沉淀；
c. 用2mL冻存液将病毒沉淀重悬，收集到15ml管中备用。
② 细胞沉淀处理
a. 细胞沉淀用6mL腺病毒冻存液重悬，混匀，反复冻融四次；
b. 冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和沉淀（细胞碎片）；
c.上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用2mL冻存液进行重悬；
③ 超声波破碎细胞
a. 重悬后的细胞碎片超声波破碎3-4次，至液体不粘稠；
b. 超声完毕后，将液体分装到2个EP管中，12000g，4℃离心10min；
c. 离心完成后，与病毒上清和细胞沉淀处理后的样品混合。 1.5 纯化与浓缩
① 纯化——碘克沙醇密度梯度离心。
a. 配制不同浓度的碘克沙醇；
b. 取一个超离管，用电动移液器逐层、缓慢加入不同浓度的碘克沙醇；
c. 将处理好的病毒液加入到最上层；
d. 超速离心，48000rpm，2h30min。离心前应将对应的超离管配平，误差控制在0.1g以内。
② 浓缩
a. 离心完毕后，将超离管底用针头刺破，收集腺病毒所在层至15mL管中；
b. 将收集的病毒液用冻存缓冲液稀释至体积15mL，然后用0.2μm的滤膜过滤；
c. 将过滤后的液体置于一个15mL的超滤管中，3500g离心50min进行浓缩，一般离心2-3次后达到预定体积；
d. 将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，标明名称和日期。
e. 将收集起来的病毒涡旋震荡混匀后离心，吸10μL病毒液进行滴度检测。 1.6 病毒滴度检测
实时定量PCR法是一种简单的、高通量的测定病毒粗提裂解液和纯化病毒样本中腺病毒颗粒数量的方法。每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
① 去除游离DNA分子
先将病毒稀释10倍，以保证样品中游离的DNA充分降解：取5μl病毒至45μl PBS缓冲液中，充分混匀。按以下体系配制Mixture：
组成成分
体积
超纯水（DNase & RNase Free）
4 μl
DNAaseI
1 μl
10×DNAaseI Buffer
1μl
病毒稀释液
4μl
Total
10μl
37℃ 孵育30 min，95℃加热5min使DNA酶失活。
② 去除病毒蛋白外壳
向上述体系中再加入 1μl蛋白酶K（5μg/μl）。37℃ 孵育30 min；再加30ul超纯水稀释至40ul（至此病毒原液稀释100倍），95℃加热5 min使蛋白酶K失活，然后12000rpm，离心2min，取上清进行qPCR检测。
③ qPCR 将步骤2得到的上清，取5μl进行10倍梯度稀释，即病毒原液稀释了1000倍。分别取2μl待测样品及标准品作为模板进行qPCR检测。
④ 数据分析
病毒颗粒数的计算：病毒颗粒数(VP/mL) =与标准品相对值×1000
窥视卡
雷达卡
提升卡
置顶卡
沉默卡
喧嚣卡
变色卡
千斤顶
照妖镜