图3 HIV-1基因组结构与慢病毒载体包装质粒系统（Dufait et al., 2013）。 3）慢病毒包装流程
① 构建目的基因真核表达载体，我司包含过表达、干扰沉默、基因敲除等系列载体，可依据不同需求，选择不同载体；
② 制备包装质粒：以去内毒素质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒（常见pLV、psPAX2、pMD2.G）；
③ 目的基因质粒载体与其他包装质粒共转染293T细胞，293T细胞株为慢病毒的包装细胞；
④ 收集病毒上清液：细胞转染后收集细胞培养上清液并过滤即可；
⑤ 病毒浓缩与纯化：为高效感染目的细胞，需将收集好的病毒上清液进行浓缩和纯化，以此提高病毒的滴度和纯度，便于下游试验的开展。 注：我司采用超速离心沉淀法或PEG8000浓缩法进行慢病毒的浓缩纯化。
⑥ 病毒滴度测定与质控：常见荧光计数法、定量PCR法检测整合到基因组DNA中的病毒序列、p24蛋白ELISA试剂盒检测法、qRT-PCR试剂盒检测法检测病毒样本中的基因组拷贝数。
图4 慢病毒包装流程示意图。 4）慢病毒优势与特点
① 感染效率高：与传统质粒转染相比，慢病毒感染无需转染试剂，且感染效率高。
② 感染谱更广：慢病毒可高效感染神经细胞、肝细胞、心肌细胞、内皮细胞、干细胞、原代细胞等多种通常不容易转染的细胞。
③ 稳定表达：相比瞬时转染，慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，并可稳定持续表达。 稳转细胞株
1）稳转细胞株简介
构建稳转细胞株的基本原理就是将外源DNA克隆到具有某种抗性（常见嘌呤霉素（Puromycin，Puro）、新霉素（Neomycin，Neo）或G418）的载体上，再将载体通过不同的转染方式转染宿主细胞，使其整合到宿主染色体中，最后采用载体抗性进行筛选，得到可稳定过表达或沉默或敲除或编辑特定基因的细胞株。经标准药筛后，我司可提供多克隆细胞群或单克隆细胞株。 2）我司细胞株类型
① 过表达基因的稳转细胞株（可选单克隆、多克隆细胞株，以及细胞传代代数）；
② shRNA基因干扰的稳转细胞株（可选单克隆、多克隆细胞株，以及细胞传代代数）；
③基于CRISPR/Csa9系统随机敲除的稳转细胞株（可选单克隆、多克隆细胞株，以及细胞传代代数）； 3）稳转细胞株构建方法
① 确定最适慢病毒感染复数（multiplicity of infection，MOI），即感染时病毒与细胞数量的比值； 注：为了达到最佳的实验效果，建议在正式实验前进行3-4种不同MOI值感染预实验。
② 确定目的细胞药物筛选浓度。不同细胞对同种抗生素，其筛选浓度不同；同种细胞对不同抗生素，其最佳使用浓度也不同。
③ 慢病毒感染目的细胞。
图6 使用慢病毒生成稳转细胞系的示意图（Tandon et al., 2018）。
以上步骤即为构建多克隆稳转细胞系流程，若需构建单克隆稳转细胞株，则还需进行以下步骤：
① 对筛选后的多克隆稳转细胞株进行稀释培养，常见方法为有限稀释法以及流式分选，我司采用有限稀释法。
② 单细胞经细胞扩增后，继续采取抗生素进行第二轮筛选；
③ 筛选完成后，收集细胞进行mRNA水平及蛋白水平检测，选择结果正常的单克隆细胞冻存保种。 参考文献
Dufait I, Liechtenstein T, Lanna A, et al. Lentiviral Vectors in Immunotherapy[M]. 2013.
Tandon N, Thakkar KN, LaGory EL, et al. Generation of Stable Expression Mammalian Cell Lines Using Lentivirus. Bio Protoc. 2018;8(21):e3073.
Xu K, Ma H, McCown TJ, et al. Generation of a stable cell line producing high-titer self-inactivating lentiviral vectors. Mol Ther. 2001;3(1):97-104.
窥视卡
雷达卡
提升卡
置顶卡
沉默卡
喧嚣卡
变色卡
千斤顶
照妖镜