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[闲聊] 生信分析-新冠病毒

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so终日缠绵 发表于 2022-1-2 04:13:32 | 只看该作者 打印 上一主题 下一主题
 
SARS-CoV-2激活肺上皮细胞促炎症信号转导导致新冠肺炎患者免疫失调

生信分析-新冠病毒 第1张图片
这篇文章发表在期刊: Ebiomedicine。2021影响因子: 8.143(↑ 2.407)。2020影响因子: 5.736。中科院大类: 医学 2区。中科院小类: 1区 医学：研究与实验。笔者认为新冠病毒这一话题为最近的热点，而本篇文章利用了生信分析的方式，很好的展示了热点话题，非常具有特色。很值得我们学习。

  • 背景知识：
由SARS-CoV-2感染引发的2019年冠状病毒病(新冠肺炎)暴发已成为全球性卫生突发事件。SARS-CoV-2属于冠状病毒家族。SARS-CoV-2与表面表达的蛋白--血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，进入与SARS-CoV相似的细胞。除了ACE2外，靶细胞上丝氨酸蛋白酶TMPRSS2的表达也是激活病毒刺突(S)蛋白以促进病毒进入所必需的。在这项研究中，作者综合评估了19例受试者(6例新冠肺炎重症患者，3例新冠肺炎轻度症状康复患者和10例健康献血员)支气管肺泡灌洗液中的单细胞测序数据。

  • 发现问题：
目前还不清楚SARS-CoV-2感染是如何导致新冠肺炎患者肺部免疫反应失调的。

  • 结果：
  • COVID19例患者肺上皮细胞高表达ACE2和TMPRSS2
在SARS-CoV-2感染的不同细胞类型中， 检测与SARS-CoV-2进入细胞有关的基因ACE2和TMPRSS2，肺支气管肺泡灌洗液(BALF)的单细胞RNA序列(scRNA-seq)数据来自NCBI数据库中3例轻度恢复者和6例重症患者(GSE145926)以及10名健康献血者(GSE151928)。无监督聚类分析鉴定出23个不同的细胞簇（Fig. 1A），包括上皮细胞(EPCAM+)和免疫细胞(PTPRC+)。ACE2和TMPRSS2主要在肺上皮细胞表达(Fig. 1B)。在肺上皮细胞中，ACE2和TMPRSS2阳性细胞在棒状细胞和纤毛细胞中所占比例较高，所以这些细胞可能是SARS-CoV-2感染的主要靶细胞(Fig. 1C)。值得注意的是，无论是重度还是轻度新冠肺炎患者的肺泡灌洗液样本中，这两种类型的肺上皮细胞中ACE2或TMPRSS2阳性细胞的百分比都显著高于健康对照组(Fig. 1D)。与上述一致，新冠肺炎患者棒状细胞和纤毛细胞中ACE2或TMPRSS2 mRNA的表达水平显著高于健康对照组(Fig. 1E)。然而，考虑到本研究样本量较小以及对这些患者的治疗，新冠肺炎患者肺上皮细胞中ACE2和TMPRSS2的表达增加与SARS-CoV-2感染之间的相关性还需要进一步深入的研究。

生信分析-新冠病毒 第2张图片

生信分析-新冠病毒 第3张图片
Fig. 1. High ACE2 and TMPRSS2 expression in lung epithelial cells from COVID-19 patients. (A) The t-SNE plot displayed the major cell types (epithelial, immune and others) in 23 clusters for bronchoalveolar lavage fluid (BALF) samples from 6 severe (S) and 3 recovered mild COVID-19 patients (M), as well as 10 healthy controls (HC). (B) The t-SNE plot displayed RNA expression of ACE2 or TMPRSS2. Right panel shows ACE2 or TMPRSS2 expression in lung epithelial cells from different groups using violin plot. (C) Dot plot of ACE2 orTMPRSS2 expression for each cell-type of lung epithelial cells from different groups. Dot size represents the percentage of cells in individual clusters expressing a given gene. (D)The pie chart shows the percentages of ACE2- o r TMPRSS2- positive cells in club (cluster 14) and ciliated (cluster 15) cells. (E) Violin plot of expression values of ACE2 or TMPRSS2 in different cell types of lung epithelial cells from different group. (F) The top 5 enriched signaling pathways of up-regulated (red) or down-regulated (green) genes in lung epithelial cells after SARS-CoV-2 infection (severe vs. health). * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.

  • SARS-CoV-2导致肺上皮细胞转录组改变
接下来，作者研究了SARS-CoV-2感染后肺上皮细胞的细胞转录组改变。在棒状细胞中，与健康对照组相比，重度新冠肺炎患者共检测到107个上调转录本和65个下调转录本(校正≤p0.0 1和|log2Fold change(FC)|≥1)。另一方面，在纤毛细胞中检测到SARS-CoV-2感染后162个上调转录本和138个下调转录本(校正≤p0.0 1和|log2Fold change(FC)|≥1)。(Fig. 1F)。另一方面，SARS-CoV2能够抑制棒状细胞中宿主蛋白的翻译(Fig. 1F)。
此外，对轻症和重症新冠肺炎患者肺上皮细胞转录组的比较分析表明，与重症患者相比，轻症患者会诱导T细胞活化信号，如MHCⅡ类抗原提呈、CD3和TCR zeta链磷酸化，同时会抑制细胞因子信号转导。与健康对照组相比，重症新冠肺炎患者肺上皮细胞中主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类基因，包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP和HLA-DM显著降低。这可能部分解释了T细胞诱导失败和患者预后差的原因。另一方面，在轻度恢复的COVID19患者中，MHCⅡ类基因的表达恢复。

  • SARS-CoV-2感染引发肺部免疫反应
作者进一步研究了SARS-CoV-2感染对免疫细胞命运的影响。将非上皮细胞重新聚为22个亚群，并基于标志物鉴定出不同的免疫细胞类型。如图Fig. 1B和Fig. 2A所示，新冠肺炎患者支气管肺泡灌洗液中的免疫细胞几乎不表达ACE2和TMPRSS2，提示免疫细胞对SARS-CoV-2感染可能不敏感。接下来，作者研究了三个巨噬细胞亚群(第2、3和6群)，两个T&NK细胞亚群(第4和5群)，以及一个中性粒细胞亚群(第0群)，因为它们包含了足够的细胞数量进行分析。亚群特异性基因的过度表达分析显示MHCⅡ类抗原提呈信号在巨噬细胞_2和巨噬细胞_6中被激活；相反，巨噬细胞_3可以发挥补体效应功能(Fig. 2B)。作者还利用SCIENIC研究了不同上皮细胞和免疫细胞亚型之间转录因子(TF)调节活性的差异，与特定细胞类型相关的多种转录因子(TF)表现出丰富的调节活性，包括巨噬细胞亚群中的TCF7L2，T和NK亚群中的GATA3和NFATC2。通过比较新冠肺炎患者和健康对照的不同免疫细胞群，作者发现SARS-CoV-2感染后肺部存在免疫应答失调(Fig. 2C) 与健康对照组相比，新冠肺炎重症患者中性粒细胞水平显著升高，但在患者康复后，中性粒细胞水平恢复到正常水平(Fig. 2C)。虽然重症新冠肺炎患者的巨噬细胞数量(第3和第6簇)明显低于健康对照组，但在康复患者中它们已恢复(Fig. 2C)。同时，与健康对照组相比，只有已经康复的、轻症的新冠肺炎患者才能诱导T/NK细胞(图2C)。
然后，作者探索了新冠肺炎患者和健康对照组肺内免疫细胞的差异基因表达谱。作者发现重症新冠肺炎患者、轻度康复新冠肺炎患者和健康对照组中性粒细胞、巨噬细胞和T/NK细胞的基因表达谱存在差异(Fig. 2D)。在重症新冠肺炎患者中，中性粒细胞、巨噬细胞和T/NK细胞(CCL2、CCL3、CCL3L1、CCL4和CCL4L2)以及中性粒细胞和巨噬细胞(CCL7和CXCL8)中的多种细胞因子均显著升高(Fig. 2D)。SARS-CoV-2感染引起的免疫细胞功能紊乱所产生的这些细胞因子的高表达提示这些患者发生了细胞因子风暴。值得注意的是，FABP4在健康对照组和轻症患者的巨噬细胞_2中高表达，而重度新冠肺炎患者的巨噬细胞2中FABP4的表达水平较高。相比之下，重症新冠肺炎患者的巨噬细胞(第2、3和6簇)中SPP1高表达。(Fig. 2D). 此外，在重症新冠肺炎患者的巨噬细胞中，Marco的表达受到抑制，这意味着感染SARS-CoV-2后的肺泡巨噬细胞可能无法清除中和病毒(Fig. 2D)。

生信分析-新冠病毒 第4张图片

生信分析-新冠病毒 第5张图片
Fig. 2. SARS-CoV-2 infection induced imbalanced host immune response in severe COVID-19 patients. (A) Dot plot of ACE2 or TMPRSS2 expression for each cell-type of lung immune cells from different groups. Dot size represents the percentage of cells in individual clusters expressing a given gene. (B) Top 5 enriched signaling pathways of markers genes for macrophage (cluster 2, 3 and 6). (C) The percentages of different immune cell types of all CD45+ cells in BALF of severe (S), recovered mild COVID-19 patients (M), and healthy controls (HC). (D) Heatmaps of transcript level of candidate genes in different immune cell types. * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.

  • SARS-CoV-2引起的肺上皮细胞与免疫细胞的异常相互作用
接下来，作者利用CellPhoneDB研究了基于不同上皮细胞和免疫细胞之间配体受体的肺内细胞间交流信息。计算出显著的细胞相互作用(P < 0.05)作者发现，与健康对照组相比，新冠肺炎患者的棒状-免疫细胞相互作用(Fig. 3A)显著增加，但纤毛-免疫细胞相互作用(Fig. 3B)并未显著增加。至于免疫-免疫细胞，轻症患者的BALF样本比重症患者和健康供者的BALF样本表现出更多的细胞相互作用(Fig. 3C)。为了了解这些相互作用是否与新冠肺炎的严重程度相关，作者进一步研究了上皮细胞和免疫细胞之间特定的细胞因子/受体相互作用。作者在重度新冠肺炎患者中发现了与巨噬细胞(或中性粒细胞)之间的ANXA1/FPR2和TNFSF13/TNFRSF1A相互作用，以及与T/NK细胞之间的CXCL2/DPP4相互作用，而在轻度患者和健康对照组中没有发现。这表明肺上皮细胞和免疫细胞之间的细胞因子/受体相互作用与新冠肺炎感染的严重程度有关(Fig. 3D)。SARS-CoV-2可能通过DPP4进入宿主细胞，并且抑制DPP4可能使患有新冠肺炎的糖尿病患者受益。此外，作者发现SARS-CoV-2感染诱导了C3/C3AR1和SAA1/FPR2在肺上皮细胞(棒状和纤毛状)与巨噬细胞(或中性粒细胞)之间的相互作用。重症新冠肺炎患者巨噬细胞间ANXA1/FPR2相互作用缺失；在轻度患者中，巨噬细胞与T/NK细胞之间存在TNFSF13/TNFRSF1A相互作用，而在重症患者和健康献血者中未见(Fig. 3D)。作者进一步验证了SARS-CoV-2感染后肺上皮细胞ANXA1、C3、CXCL2、SAA1和TNFSF13的表达。结果表明，重症新冠肺炎患者肺上皮细胞中ANXA1、C3和SAA1的表达均显著高于正常对照组。SARS-CoV-2感染后肺上皮细胞中CXCL2的表达呈上升趋势，而TNFSF13的表达无明显变化，作者的结果，提示SARS-CoV-2感染后，肺内上皮细胞和免疫细胞之间形成了特异性网络，这可能与COVID19感染的严重程度有关。

生信分析-新冠病毒 第6张图片

生信分析-新冠病毒 第7张图片
Fig.3. SARS-CoV-2 infection resulted in abnormal epithelial-immune cell interaction in lung. (A-C) We evaluated intercellular communications based on expression of ligand receptor pAIrs among different cell types by CellPhoneDB. Club-immune cells (A), ciliated-immune cells (B), and immune-immune communications (C) in severe (S, n=6),recovered mild (M, n=3) COVID-19 patients, and healthy controls (HC, n=10) were shown. Only significant interactions were calculated, and the number of interactions was depicted in violin plot, or normalized against those of healthy controls in heatmap. (C) Heat map depicting different ligand receptor interactions among different cell types. Interaction strengths are color coded. [One-way Analysis of Variance (ANOVA) followed by Tukey multiple comparisons (A-C)]. * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001; **** P < 0.0001.

  • 本文小结：
总之，SARS-CoV-2感染可诱导高表达ACE2和TMPRSS2的肺上皮细胞(纤毛上皮细胞和杆状上皮细胞)基因表达谱异常和促炎信号激活。此外，SARS-CoV-2感染导致肺部免疫反应失调，产生大量促炎因子，破坏上皮细胞和免疫细胞之间的相互作用。所有这些都加剧了新冠肺炎感染的严重性(Fig. 4)。

生信分析-新冠病毒 第8张图片
Fig. 4. SARS-CoV-2 infection and host immune response in COVID-19 patients. In COVID-19 patients, the SARS-CoV-2 may infect ciliated cells, club cells, and basal cells expressing ACE2 and TMPRSS2 in lung epithelium and actively replicate in host cells. This could lead to activation of pro-inflammatory signaling and production of pro-inflammatory cytokines which subsequently attract both innate and adaptive immune cells including neutrophils, macrophages and T cells to the infection site to fight virus and virus-infected cells. Besides, the immune cells also release cytokines to attract more immune cells, creating a positive feedback loop of cytokine creation. Massive accumulation of pro-inflammatory cytokines producing-immune cells in the lungs could increase the severity of COVID-19 patients.


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标签：信号转导影响因子实验小类医学
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